可溶性蛋白纯化（His-标签，Ni-NTA柱法）试剂盒（非变性）

名称：可溶性蛋白纯化（His-标签，Ni-NTA柱法）试剂盒（非变性）

英文名称：His-labeled protein Purification (NI-NTA column) kit（Native）

目录号：QYP1062

保存条件：室温（15-25℃），4℃

保质期：1年

包含试剂：

赠送凝胶保护液1瓶(约100ml,20%PBS乙醇溶液，4℃）

产品介绍：

His-标签蛋白纯化（Ni-NTA柱法）试剂盒用于实验室的His标签融合蛋白纯化。本试剂盒预装柱，我们已经给填装好，客户可直接使用。

表达菌株经IPTG诱导表达蛋白、超声破碎、离心分离后的上清，流经His-标签蛋白纯化填料柱，样本中的His标签蛋白与纯化填料特异性结合，其他杂蛋白则不与柱子结合。样本经洗涤液洗涤除杂后，加入洗脱液，洗脱His标签蛋白。单次蛋白纯化得率因蛋白种类、蛋白分子量大小而异。每根Ni-NTA琼脂糖凝胶柱可反复使用8-10次，其His标签蛋白结合效率不会显著降低。

    本试剂盒中的His-标签蛋白纯化填料可兼容8M尿素和6M盐酸胍，亦可进行包涵体蛋白纯化。如需进行包涵体蛋白纯化，请购买

包涵体蛋白纯化（His-标签，Ni-NTA柱法）试剂盒（变性）（QYP1063）。如需蛋白纯化试剂补充，请购买可溶蛋白纯化（His-标签，Ni-NTA柱法）试剂盒（非变性）补充装（QYP1064）。

实验例：

实验名称：可溶性His-标签蛋白纯化

I. 大肠杆菌中可溶性His标签蛋白的诱导表达

1. 挑取表达菌株单克隆，接种到5ml含抗生素的LB培养基中，培养过夜。

2. 按照1：50-1：100的比例，取培养过夜的菌液，接种到100ml含抗生素的LB培养基中。

3. 将菌液在37℃恒温摇床震荡培养1h左右，至菌液的OD600达到0.8-1.0。

4. 加入1mM IPTG，继续培养4-5h。

5. 收集菌液至离心管中，4000g离心10min，弃上清，收集菌体，-20℃或-80℃冻存备用。

注：可在诱导表达前取出少量菌液，不加IPTG，同样培养4-5h后作为未诱导的对照。对于特定蛋白的诱导表达，需通过实验确定最佳的IPTG浓度、诱导温度、诱导时间。

II. 菌体的超声破碎

将菌体解冻，加入10ml PBS，吹打混匀，充分重悬菌体。可在混悬液中添加IPTG及蛋白酶抑制剂。将菌体混悬液置于冰水混合物中，放入超声破碎仪，使探头浸入菌体混悬液液面下。将超声破碎仪调节至功率200-300w，工作10s，间隔10s，共6个循环。开始超声。

P.S. 因不同实验室超声破碎仪型号、探头大小、裂解菌体量不同，上述实验条件仅供参考。客户需自行优化最适实验条件。如超声后菌液依然非常浑浊，应适当增加功率，延长超声时间。

超声破碎结束后，10000g， 4℃离心20min。将上清与沉淀分开保存。SDS-PAGE电泳检测。确定蛋白是可溶性（上清）表达还是包涵体（沉淀）表达。

 III．His蛋白的非变性纯化

1. 装柱：将His-标签蛋白纯化填料混匀。将下层筛板置于层析柱空柱底部。用剪开枪头尖的1ml枪头吸取2ml His-标签蛋白纯化填料混悬液，加入层析柱空柱。待液体流出后（柱床体积1ml），向层析柱中加入PBS，将上层筛板置于层析柱顶部，小心向下推直到接触凝胶表面，压实。筛板和凝胶层之间不要有气泡。

2. 平衡：用平衡液洗柱子10个柱床体积。

3. 加样：将上清上柱。接住流穿液，反复上柱2-3次，使His标签蛋白与蛋白纯化填料充分结合。

P.S.上清必须保持澄清，不能含有任何不可溶杂质。否则会堵柱子，影响纯化获得蛋白的纯度。若杂质较多，可10000g，4℃，10min离心1-2次，经滤纸过滤，再经0.45um滤器过滤。

5. 洗涤：用洗涤液洗柱子10个柱床体积。

6. 洗脱：用洗脱液洗脱目的蛋白5-10个柱床体积。将样本收集到1.5ml或2ml EP管中。

7. 再生：用平衡液洗柱子10个柱床体积。

8. 保存：使用后的柱子应加入20%乙醇-PBS，盖上上下盖，直立保存在4℃。

9. 洗脱下来的蛋白可用BCA 蛋白定量试剂盒和SDS-PAGE电泳鉴定其浓度和纯度。

实验结果举例：