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5T | 6500.00 | 5200.00 | 11 |
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图片描述: | ||||
5T |
LncRNA克隆前的重要预实验
方法:取可能有表达目的lncRNA的总RNA,均分为两份,其中一份以6碱基或9碱基的随机引物进行反转录(命名为cDNA1),另外一份以Oligo dT(15)或Oligo dT(18)进行反转录(命名为cDNA2),转录好的cDNA,按照下列体系,使用基因特异性引物以分别进行扩增、测序,验证目的基因是否表达(建议使用某品牌HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper),货号R133-01*)。
已知基因或LncRNA带有polyA尾的情况下,使用cDNA2的方式进行后续验证试验即可!
*: HiScript 两步法Select RT-qPCR预混液(含gDNA去除模块)以高性价比的HiScript Reverse Transcriptase为基础,针对不同实验设计可灵活使用不同类型的逆转录引物,满足多样化的用户需求。可根据逆转录后续实验需要选择Oligo (dT)18primer/Random Hexamers或基因特异性引物(GSP)。产品中的4 × gDNA wiper可在逆转录步骤前快速彻底去除体系中潜在的基因组干扰,5 ×qRT SuperMix 含有反转录反应除引物以外所需的全部试剂且在-20℃不会冻结,使用方便。
PCR扩增酶:
酶——某品牌TransStart® Taq DNA Polymerase(货号AP141)是新型的热启动酶,是利用两种DNA结合蛋白分别与引物和模板高效结合,一种结合蛋白和引物结合,阻止了低温下引物形成二聚体;另一种结合蛋白和模板结合,阻止了低温下DNA聚合酶与DNA模板结合。随着变性步骤的进行,两种蛋白失活,释放的引物与模板参与扩增反应,增强PCR扩增效率和扩增特异性。扩增产物3'端带“A”碱基,可直接克隆于pEASY®-T系列载体中。
PCR扩增体系:
PCR反应组分配制
组分 |
检测样品 |
10× STransStart® Taq DNA Polymerase Buffer |
2.5 μL |
dNTP Mix ( |
4~5 μL |
GSP1(10 μM) |
0.2 μL |
GSP2(10 μM) |
0.2 μL |
cDNA(试验样) |
1~2 μL |
TransStart® Taq DNA Polymerase |
0.5~1 μL |
PCR-Grade Water |
至50 μL |
如果目的lncRNA带有polyA尾,cDNA1和cDNA2均可获得目的扩增条带,如果经测序验证为目的序列后,这两条基因特异性引物可以用于后续的RACE试验。
如果目的lncRNA不带有polyA尾,仅有cDNA1可以获得目的扩增条带,cDNA2则无扩增产物,如果经测序验证为目的序列后,这两条基因特异性引物可以用于后续的RACE试验。
经过上述方式,即可确定lncRNA是否带有polyA尾。使用同一cDNA样品与某一看家基因进行实时定量PCR,确定目的基因的表达水平。
RACE cDNA Synthesis Kit简要操作步骤
使用QualitYard™ RACE cDNA Synthesis Kit(QY0011S)进行RNA反转录。
(1)每个样品及对照均在0.2或0.5 mL PCR反应管内添加下列组分:
制备可同时用于5'和3'-RACE用的cDNA |
13 µL总RNA (总量≤4 µg) |
1 µL SUPERSWITCH™ 3RRT2 |
2µL dNTP Mix (10 mM of each dNTP) |
(2)吸打混匀并瞬时离心。70℃孵育5 min,立即冰浴5 min。
(3)瞬时离心使溶液收集于管底。
(4)在离心管中添加下列组分:
5× First-Strand Buffer |
5 µL |
SUPERSWITCH™ Reverse Transcriptase |
1 µL |
RNase Inhibitor |
1 µL |
SUPERSWITCH™ BufferⅠ |
0.5 µL |
SUPERSWITCH™ BufferⅡ |
0.5 µL |
总体系24 µL(5'-RACE) |
(5)吸打混匀,并避免产生气泡,瞬时离心收集溶液。42℃的空气浴或PCR仪上孵育30 min;
(6)加入1 µL SUPERSWITCH™ 5RRT,并吸打混匀,42℃继续孵育1 h。
(7)72℃PCR仪上加热7 min。将PCR反应管置于冰上终止第一链cDNA合成。反转录产物可同时用于3'和5' RACE。反转录完毕后,立即将cDNA进行每管3 µL的分装,每次进行PCR扩增取3 µL及其整倍数的分装cDNA即可!
所得产品可以在–20℃下保存3个月。
扩增条件为PCR 第一轮
第一轮PCR产物取5~10 μL于1.5%琼脂糖凝胶电泳,拍照。
扩增条件为PCR,第二轮PCR倍】稀释,进行第二轮100倍【根据产物浓度可以稀释至50~10不同温度下的扩增产物,混合均匀,并进行PCR吸取第一轮
表1、基因 5' RACE 第一次PCR扩增方案(替代扩增酶全式金的AP141)
组分 |
5'-RACE(μL) |
10×SUPERSWITCH™ Hot Start Buffer |
2.5 |
(dNTP Mix |
2.5 |
第一次PCR 使用RACE-RACE-Ready cDNA |
0.5 |
SUPERSWITCH™ Hot Start DNA polymerase |
0.2 |
5AP(10 μM) |
0.2 |
基因特异性引物1(10 μM第一轮PCR)[如5R1] |
0.2 |
H2O |
至25 |
终体系 |
25 |
表2、基因 5' RACE 第二次PCR扩增方案(替代扩增酶全式金的AP141)
组分 |
5'-RACE(μL) |
10×SUPERSWITCH™ Hot Start Buffer |
2.5 |
(dNTP Mix |
2.5 |
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For more information, please download and refer to the product manual。