| Size | List Price |
Promotion Price | Stock |
Purchase |
|---|---|---|---|---|
| 5T | 6500.00 | 5200.00 | 11 |
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| 图片描述： | ||||
| 5T | ||||
LncRNA克隆前的重要预实验
方法：取可能有表达目的lncRNA的总RNA，均分为两份，其中一份以6碱基或9碱基的随机引物进行反转录（命名为cDNA1），另外一份以Oligo dT（15）或Oligo dT（18）进行反转录（命名为cDNA2），转录好的cDNA，按照下列体系，使用基因特异性引物以分别进行扩增、测序，验证目的基因是否表达（建议使用某品牌HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)，货号R133-01*）。
已知基因或LncRNA带有polyA尾的情况下，使用cDNA2的方式进行后续验证试验即可！
*: HiScript 两步法Select RT-qPCR预混液（含gDNA去除模块）以高性价比的HiScript Reverse Transcriptase为基础，针对不同实验设计可灵活使用不同类型的逆转录引物，满足多样化的用户需求。可根据逆转录后续实验需要选择Oligo (dT)18primer/Random Hexamers或基因特异性引物（GSP）。产品中的4 × gDNA wiper可在逆转录步骤前快速彻底去除体系中潜在的基因组干扰，5 ×qRT SuperMix 含有反转录反应除引物以外所需的全部试剂且在-20℃不会冻结，使用方便。
PCR扩增酶：
酶——某品牌TransStart® Taq DNA Polymerase（货号AP141）是新型的热启动酶，是利用两种DNA结合蛋白分别与引物和模板高效结合，一种结合蛋白和引物结合，阻止了低温下引物形成二聚体；另一种结合蛋白和模板结合，阻止了低温下DNA聚合酶与DNA模板结合。随着变性步骤的进行，两种蛋白失活，释放的引物与模板参与扩增反应，增强PCR扩增效率和扩增特异性。扩增产物3'端带“A”碱基，可直接克隆于pEASY®-T系列载体中。
PCR扩增体系：
PCR反应组分配制
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组分 |
检测样品 |
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10× STransStart® Taq DNA Polymerase Buffer |
2.5 μL |
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dNTP Mix ( |
4~5 μL |
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GSP1（10 μM） |
0.2 μL |
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GSP2（10 μM） |
0.2 μL |
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cDNA（试验样） |
1～2 μL |
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TransStart® Taq DNA Polymerase |
0.5~1 μL |
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PCR-Grade Water |
至50 μL |
如果目的lncRNA带有polyA尾，cDNA1和cDNA2均可获得目的扩增条带，如果经测序验证为目的序列后，这两条基因特异性引物可以用于后续的RACE试验。
如果目的lncRNA不带有polyA尾，仅有cDNA1可以获得目的扩增条带，cDNA2则无扩增产物，如果经测序验证为目的序列后，这两条基因特异性引物可以用于后续的RACE试验。
经过上述方式，即可确定lncRNA是否带有polyA尾。使用同一cDNA样品与某一看家基因进行实时定量PCR，确定目的基因的表达水平。
RACE cDNA Synthesis Kit简要操作步骤
使用QualitYard™ RACE cDNA Synthesis Kit（QY0011S）进行RNA反转录。
（1）每个样品及对照均在0.2或0.5 mL PCR反应管内添加下列组分：
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制备可同时用于5'和3'-RACE用的cDNA |
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13 µL总RNA （总量≤4 µg） |
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1 µL SUPERSWITCH™ 3RRT2 |
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2µL dNTP Mix (10 mM of each dNTP) |
（2）吸打混匀并瞬时离心。70℃孵育5 min，立即冰浴5 min。
（3）瞬时离心使溶液收集于管底。
（4）在离心管中添加下列组分：
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5× First-Strand Buffer |
5 µL |
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SUPERSWITCH™ Reverse Transcriptase |
1 µL |
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RNase Inhibitor |
1 µL |
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SUPERSWITCH™ BufferⅠ |
0.5 µL |
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SUPERSWITCH™ BufferⅡ |
0.5 µL |
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总体系24 µL（5'-RACE） |
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（5）吸打混匀，并避免产生气泡，瞬时离心收集溶液。42℃的空气浴或PCR仪上孵育30 min；
（6）加入1 µL SUPERSWITCH™ 5RRT，并吸打混匀，42℃继续孵育1 h。
（7）72℃PCR仪上加热7 min。将PCR反应管置于冰上终止第一链cDNA合成。反转录产物可同时用于3'和5' RACE。反转录完毕后，立即将cDNA进行每管3 µL的分装，每次进行PCR扩增取3 µL及其整倍数的分装cDNA即可！
所得产品可以在–20℃下保存3个月。
扩增条件为PCR 第一轮
第一轮PCR产物取5～10 μL于1.5%琼脂糖凝胶电泳，拍照。
扩增条件为PCR，第二轮PCR倍】稀释，进行第二轮100倍【根据产物浓度可以稀释至50～10不同温度下的扩增产物，混合均匀，并进行PCR吸取第一轮
表1、基因 5' RACE 第一次PCR扩增方案（替代扩增酶全式金的AP141）
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组分 |
5'-RACE（μL） |
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10×SUPERSWITCH™ Hot Start Buffer |
2.5 |
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（dNTP Mix |
2.5 |
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第一次PCR 使用RACE-RACE-Ready cDNA |
0.5 |
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SUPERSWITCH™ Hot Start DNA polymerase |
0.2 |
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5AP（10 μM） |
0.2 |
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基因特异性引物1（10 μM第一轮PCR）[如5R1] |
0.2 |
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H2O |
至25 |
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终体系 |
25 |
表2、基因 5' RACE 第二次PCR扩增方案（替代扩增酶全式金的AP141）
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组分 |
5'-RACE（μL） |
|
10×SUPERSWITCH™ Hot Start Buffer |
2.5 |
|
（dNTP Mix |
2.5 |
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For more information, please download and refer to the product manual。
COA
