概述

神经干细胞(neural stem cell，NSC)是一类存在于神经组织中，具有自我更新和多向分化潜能的细胞，可通过不对等的分裂方式产生诸如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等各类神经组织细胞。近年来神经干细胞以其替代、修复受损细胞的生物学特性成为治疗帕金森病、脑血管病、脑瘤、脊髓损伤、阿尔茨海默病等多种神经系统疾病的新的治疗手段。

培养方法

原代培养

目前，神经干细胞的分离方法主要有三种：无血清培养基自然筛选法、流失细胞术分选法、免疫磁珠分选法。其中无血清培养基自然筛选法最为简单和易操作，且行之有效，应用最为广泛。

无血清培养基自然筛选法的原理是利用特殊的培养基使成熟的神经细胞无法较长时间地成活，而分离筛选出能够在该培养条件下存活并增殖的神经干细胞群体。首先将含神经干细胞的神经组织通过机械或酶解分散等方法制备成单细胞，然后培养于含有特殊营养添加剂和促增殖因子的不含血清的培养液中。非神经干细胞在这种培养系统中由于营养缺陷无法较长时间地存活，而神经干细胞则适应该培养体系并在促增殖因子作用下生长增殖。因此，经过培养一段时间之后，就可获得通过这种自然筛选而增殖形成的呈神经球状生长的神经干细胞群体。这种利用特殊培养基自然筛选神经干细胞方法的优点是：简便易行，不需要特殊的仪器设备等条件，分离效率高，神经干细胞损伤小易于成活。

操作步骤

以大鼠神经干细胞为例：

1. 无菌条件下取新生SD大鼠(出生48h内)脑组织；

2. D-Hanks液充分漂洗后，在解剖显微镜下剥离脑膜，准确分离海马，用眼科剪将海马剪碎后；

3. 再转移到DMEM/F12(1:1)加B27和bFGF(20ng/ml)的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液；

4. 台盼蓝染色后细胞计数，调整细胞浓度为5×104个/ml；

5. 置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μl；

6. 待神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液；

7. 仍以5×104个/ml的细胞浓度置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μl；

8. 此后每7d机械分离克隆传代1次，方法同前。

神经干细胞鉴定

由于神经干细胞的数量很少，从细胞形态来看神经干细胞为圆形或椭圆形，无或有较短的突起，核质比大，核染色较深，形态上与其它种类的细胞没有明显的差异，并且未找到一种细胞表面特异性标志物，因此目前鉴定神经干细胞主要有以下3个方面：特异性神经抗原的表达，包括巢蛋白、Musashi、转录因子及细胞黏附分子；自我更新能力，包括单细胞克隆分析、BrdU标记S期细胞；多向分化潜能，包括免疫细胞化学法、聚合酶链反应色法。传统方法是利用神经干细胞的3种特性有效并准确地鉴定了神经干细胞，这种方法也是应用最为广泛的一种鉴定方法。

特异性神经抗原的表达

成体中枢神经干细胞表达巢蛋白、Musashi、Notch1和胶原纤维酸性蛋白，但在中枢神经系统其他类型的细胞中也有不同程度的表达。此外，神经干细胞选择性的表达CD133+/CD34-/CD45以及前脑表面胚胎抗原1、A2B5、SSEA-1 (CD15)、CD29、CD146、p75(CD271)、CD9、CD81、CD95等表面标志。

自我更新能力的检测

单细胞克隆分析：神经干细胞的自我更新能力的鉴定 可采用有限稀释法进行单细胞克隆培养，直接观察原代及子代的克隆率。动态观察单个细胞的生长及增殖状况，发现培养一两天后部分单细胞体积增大，然后分裂，随着培养时间延长，逐渐形成大小不等的细胞球。

BrdU标记S期细胞：为了进一步证实实验中得到的细胞 是否具有自我更新能力，可对神经干细胞进行5'-溴尿嘧啶的掺入实验。5'-溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的同源替代物，可以在细胞周期的S期掺入到细胞核DNA内，其生物利用度一般为2 h。如果神经干细胞在丝裂原的刺激下能够进行增殖，就会将5'-溴尿嘧啶整合入细胞DNA。DNA链中只要有0.5%的胸腺嘧啶被5'-溴尿嘧啶取代，就可以利用5'-溴尿嘧啶单抗标记技术检测出来，该方法简便，准确。无论是研究体内、体外神经干细胞的增殖和自我更新，还是进行移植前的标记，5'-溴尿嘧啶的应用都最为广泛。