纳米转染
纳米技术的新型转染试剂-NanoFectin Transfection Reagent,它能够在DNA和RNA存在时自我组装成纳米粒子,这些混合物很容易被目标细胞用于基因的高效传递,从而将外源分子如DNA,siRNA等导入细胞,是领先于脂质体转染的新型细胞转染工具。
纳米转染原理
作用机理为纳米粒子携带目的基因通过细胞内吞作用进入细胞,并有效促进目的基因-转染试剂复合体从细胞内溶酶体的释放,以及目的基因在细胞内的有效释放。
纳米转染操作步骤
质粒DNA转染 (24孔板)
1)细胞转染前应铺板18-24小时,使细胞密度在转染时达到50〜80%的汇合率。
2)在转染前2小时向每孔添加0.5 ml新鲜的含血清和抗生素的完全培养基。
3)对于每孔,在EP管中稀释0.5 μg DNA到50μl无血清DMEM中,轻轻混匀。
4)在同一管中加入1μl 转染试剂,涡旋5-10秒,短暂离心使之聚集到底部。
5)室温孵育15分钟,促进转染试剂/ DNA复合物的形成。
6)将50μl 转染试剂/ DNA混合物滴至细胞,轻轻混匀。
7)将细胞放回培养箱中继续培养。
8)转染24-48小时后检查转染效率。
包装慢病毒程序
转染前18-24小时,接种293TN或293FT细胞,使细胞密度在转染时达到60〜80%的汇合率。
向2ml EP管中添加1-1.6ml DMEM(无血清)。
向EP管中添加45μl pPACKH1和4.5μg目标质粒,吹打混匀。
再加入55μl 转染试剂,vortex 10秒混匀。
在室温下孵育DMEM-质粒-转染试剂混合物15分钟。
把DMEM-质粒-转染试剂混合物滴入平板中,轻轻涡漩。
将培养板放回培养箱(37℃,5%的CO2)中继续培养。
siRNA转染(24孔板)
转染前16-24小时,接种细胞,使细胞密度在转染时达到40〜60%的汇合率。
准备siRNA:用RNase-Free Buffer (pH 7.5) 稀释siRNA至10μM。94℃,加热2分钟。冷却至室温, 分装,-20℃存储。
准备转染试剂-siRNA复合物:向EP管中添加100μl无血清DMEM,向每管中添加SiRNA(20 pmol, 40 pmol, 80 pmol),测试最佳加入量。向每管中加入1μl 转染试剂,涡漩5秒,然后短暂离心。室温孵育15分钟。
将转染试剂-siRNA混合物滴加到每个孔中。
将培养板放回培养箱(37℃,5%的CO2)中继续培养1-3天。