分子克隆常见问题

 

大质粒 （>5kb 质粒模板）突变阳性率过低怎么办？

可能的原因有下面几个：

模板质粒用量太少：建议使用 100~150 ng 模板。

模板结构复杂：建议在 25μL的反应体系中加入 0-0.75μL PrimeSolution。一般加入 0.75μL PrimeSolution 在 25μL中可以达到满意结果， 但有些长模板质粒可能需要加入1.5μL左右才能达到预期结果。

模板和引物浓度不匹配：需要优化模板和引物的加入量。

 

定点突变没有或只长了极少量菌落是什么原因？

主要有下面3种可能：

PCR 反应失败：PrimeMut dNTPs失效； 尽量避免PrimeMut dNTPs的反复冻融，建议把PrimeMut dNTPs 分装成小份冻存于−20℃；请不要用传统dNTPs替代PrimeMut dNTPs；模板质量也很重要，使用高纯度的质粒DNA作为模板，电泳检测质粒完整性和浓度；可将95℃预变性时间延长为4min，退火时间延长至50~60 sec。

转化失败：使用转化效率为108 cfu/μg DNA的感受态细胞；把DpnI消化后的产物进行乙醇沉淀纯化，尽可能把这些产物多加到感受态细胞中；如果使用了矿物油，应尽量使用尖、细的枪头，伸入到矿物油下方吸取反应液。

抗生素用错或浓度过高：使用适当浓度的抗生素琼脂糖平板。

 

挑克隆检测发现突变阳性率过低，怎么办？

有下面几种原因和对应的解决方法：

Dpn I消化效果不佳：加入Dpn I后应混匀并短暂离心并/或适当延长消化时间。

模板质粒用量不合适：建议使用50~100 ng模板。

引物降解失效：引物应适量分装，−20℃保存，避免反复冻融。

菌株使用不当：请确认使用提取的质粒的菌株为dam +， 如果使用了dam− 的菌株(比如JM110或SCS100），这些菌株缺少甲基化能力，它们产生的质粒不能被DpnI消化。

 

测序发现突变位点与预期不符是什么原因？如何解决？

可以从下面几个方面着手改进：

引物设计不理想：重新设计引物；提高退火温度。

合成的引物质量较差或纯度不够：仅通过脱盐处理的引物突变效率偏低，请选择可信赖的引物供应商， 使用 PAGE或 HPLC 纯化级别的引物。

 

转化后菌落长得很多是什么原因？

可能有如下几个原因：

Dpn I消化不完全：加入Dpn I后应混匀并短暂离心；适当延长消化时间。

未加抗生素或抗生素浓度过低：使用适当浓度的抗生素琼脂糖平板。

转化的模板过多：转化时加入 1-2μL模板。

 

qRT-PCR为什么无Ct值（信号）出现？

可能的原因如下：

反应循环数不够：一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45循环）， 但高于45个循环会增加过多的背景信号。

检测荧光信号的步骤有误：一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。

模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况发生。

目的基因在组织中不表达或者表达量低：尝试其它组织。

 

为什么Ct值出现过晚？

可以尝试从下面几点查找：

反应条件不佳：设计更好的引物或探针；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

PCR各种反应成分的降解或加样量的不足：更换PCR各种反应成分或增加上样量。

扩增产物片段过长：建议采用100-200bp的扩增长度。

为什么阴性对照也出现明显的扩增？

阴性对照也有扩增，需要从下面几个方面排查原因：

荧光PCR mix或水被污染：更换PCR mix或水。

模板结构复杂：仅通过脱盐处理的引物突变效率偏低，请选择可信赖的引物供应商， 使用 PAGE或 HPLC 纯化级别的引物。

模板和引物浓度不匹配：在35个循环后阴性出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析。

反应过程中探针出现降解：用PAGE电泳对探针进行检测。

 

溶解曲线不止一个主峰，什么原因？

有下面几种可能：

引物设计不理想：避免引物二聚体和发夹结构的出现。

引物浓度不佳：适当降低引物的浓度。

退火温度低：适当提高退火温度。

镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度。

模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的污染，在RNA提取过程中使用DNaseI去除RNA中混有的基因组DNA。

 

实验重复性不好是什么原因？

有下面几种可能：

加样不准确：使用预混液；尽可能少换枪头；反应液混匀。

模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。