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细胞表面抗原染色——直接标记

A. 所需溶液和试剂
1. 磷酸盐缓冲液 (C01-01002):0.1M PH7.4 1X PBS
2. 固定液:4%多聚甲醛溶液(无甲醇)(C01-06001);1%多聚甲醛溶液(无甲醇)(C03-02001)
3. 穿膜剂(C01-03001):0.3% tritonX-100
4. 抗体封闭液(C03-03001):10%山羊血清溶液
5. 孵育缓冲液(C03-03002):2% BSA的0.1M PBS
6. 抗体稀释液(C01-04001):1% BSA, 0.03% Proclin300的0.1M PBS
B. 样本处理——固定
1. 离心收集细胞,弃上清。
2. 将细胞重悬在1 ml PBS(C01-01002)中。加入等体积甲醛溶液(C01-06001)至终浓度为2%,37°C固定10分钟。(或者用70%的冰乙醇5-10ML ,4℃固定16小时)
3. 放在冰上降温1分钟后加入1 X PBS ,800rpm离心5min去上清,重复一次。
C. 抗体标记
1. 将0.5-1 x 106个细胞分到各检测管中。
2. 各管加入2 ml PBS(C01-01002),200g离心5分钟, 回收细胞;重复一次。
3. 向每支检测管中加入100μl孵育缓冲液 (C03-03002)重悬细胞。
4. 再向每支样品管中加入100μl 10%山羊血清的孵育缓冲液(C03-03001),室温,封闭15分钟。
5. 向每支样品管中加入经抗体稀释液(C01-04001)按合适比例稀释后的荧光一抗,室温孵育30分钟。
6. 加入2 ml孵育缓冲液,200g离心5分钟,离心回收细胞;重复一次。
7. 将细胞重悬在1%多聚甲醛溶液(C03-02001)中然后用流式细胞仪检测。

注意:1)甲醛溶液加入量为1X106cells / m L。2)冰乙醇与冰甲醇的加入方法:向细胞中逐滴加入冰乙醇;向细胞中缓慢加入冰甲醇。3)同型对照的设置。 4)标记前细胞计数。 流

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